1 实验新手必知http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1114/c19072a405106/page.htm... 1

1.1实验室公约... 1

1.1.1实验室安全、卫生... 1

1.1.2实验室管理制度... 3

1.2酶的使用指南... 6

1.3甘油冻存菌、引物、质粒、蛋白的保存... 7

2 分子生物学实验技术http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1114/c19072a405107/page.htm... 9

2.1分子克隆及相关实验技术... 9

2.1.1分子克隆... 9

2.1.2引物设计... 13

2.1.3Gibson assembly. 15

2.1.4质粒抽提-大抽... 17

2.1.5化学法E. Coli感受态制备... 18

2.1.6电转化感受态制备... 20

2.1.7氯化铷法感受态... 21

2.1.8Trizol法提取真核细胞总RNA. 23

2.1.9体外逆转录... 25

2.1.10实时荧光定量PCR. 26

2.1.11基因定点突变... 27

3 蛋白生化与生物物理技术http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1114/c19072a405119/page.htm... 30

3.1蛋白质表达系统... 31

3.1.1 E. coli蛋白表达系统... 31

3.1.2哺乳动物表达系统... 39

3.1.3昆虫表达系统... 41

3.1.4硒代蛋白表达... 44

3.2蛋白纯化技术... 45

3.2.1 AKTA使用规则及使用实例... 45

3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法... 54

3.2.3透析袋的使用... 63

3.2.4浓缩管的使用... 64

3.2.5 TEV蛋白酶的使用... 66

3.2.6金属螯合层析... 68

3.2.7分子筛... 70

3.2.8疏水作用层析... 73

3.2.9离子交换层析... 75

3.2.10 Protein A/G 纯化抗体... 77

3.2.11谷胱甘肽转移酶 (GST) 亲和层析... 78

3.2.12 Fab的蛋白表达... 79

3.2.13植物种子蛋白的提取方案... 81

3.2.14包涵体复性... 83

3.2.15 SDS-PAGE凝胶电泳... 85

3.2.16 GraphPad Prism软件的使用... 87

3.3筛选与蛋白互作的分子... 91

3.3.1酵母双杂交技术从文库中筛选与蛋白X结合的蛋白... 91

3.3.2噬菌体展示... 95

3.3.3配体指数富集的系统进化技术筛选核酸适配体... 104

3.4检测蛋白与互作分子的互作... 108

3.4.1酵母双杂交 Yeast two hybrid. 108

3.4.2双分子荧光互补Bimolecular fluorescence complementation. 111

3.4.3 Western Blotting. 114

3.4.4免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation. 118

3.4.5差示扫描荧光技术Differential Scanning Fluorimetry. 121

3.4.6荧光偏振Fluorescence polarization. 124

3.4.7等温滴定微量热Isothermal Titration Calorimetry. 128

3.4.8表面等离子共振技术Biacore. 133

3.4.9蛋白质交联Crosslink. 135

3.4.10 Native-PAGE. 137

3.4.11静态光散射Static light scattering. 143

3.4.12凝胶阻滞实验EMSA-electrophoretic mobility shift assay. 146

3.5蛋白生化实验技术... 149

3.5.1蛋白酶活性检测... 149

3.5.2 ATP酶活检测... 153

3.5.3解旋酶活性检测... 154

3.5.4体外转录实验... 156

4 细胞生物学实验技术http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1115/c19072a405202/page.htm... 161

4.1细胞间使用规则... 161

4.2细胞系的冻存与复苏... 164

4.3细胞系的传代与培养... 165

4.4细胞系转染... 166

4.5用PEI于贴壁细胞瞬转... 168

4.6细胞系基因敲低技术... 169

4.7 NF-κB启动子活性检测... 171

5 结构生物学实验技术http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1116/c19072a405209/page.htm... 175

5.1圆二色谱... 176

5.2小角散射... 180

5.3负染... 183

5.4冷冻电镜样品制备... 189

5.5蛋白结晶实验... 190

5.5.1结晶筛选... 190

5.5.2结晶条件优化... 194

5.5.3晶体冻存... 196

5.6晶体衍射及数据收集... 198

5.7单晶衍射数据收集要点... 200

5.8 XDS预处理衍射数据... 201

5.9XDS-J Version Theta

5.10分子置换法解相位... 208

5.11结构优化检查清单... 209

5.12如何修正低分辨率的结构(5-6 Å)211

5.13结构解析软件的使用... 212

5.13.1 HKL2000 基本操作... 212

5.13.2 CCP4基本操作... 223

5.13.3 Phenix基本操作... 239

5.13.4 Phenix.refine 常见问题和解答... 254

5.13.5 Pymol 基本操作... 265

5.13.6用Pymol创建动画... 269

5.13.7用pymol和APBS画静电表面... 269

5.13.8用Autodock做分子对接... 270

5.14使用PISA进行生物大分子结构互作界面分析... 272

5.15 Linux系统管理和常用命令... 285

6 附录http://TJlab.ustc.edu.cn/2019/1116/c19072a405211/page.htm... 289

6.1试剂配方类... 289

6.1.1常用抗生素配方... 289

6.1.2常用母液配方... 290

6.1.3缓冲液(pH 6-10)的pKa及缓冲范围... 293

6.1.4磷酸缓冲液配方... 294

6.2资源信息类... 296

6.2.1常用网站... 296

6.2.2通用测序引物... 297

6.2.3密码子及其偏好性表格... 298

6.2.4空间群表格... 301

6.2.5线站新衍射仪BL17U1. 302

6.2.6实验室载体... 302

6.2.7实验室细胞株及菌株... 307