3.1.1.1  E. coli蛋白表达检测

r  试剂（REAGENTS）

1.  第一天：转化重组质粒至表达菌株，37 °C培养箱过夜培养16 h。

2.  第二天：挑单克隆于5 mL抗性培养基（一般一种菌株挑取2-5个单克隆），37 °C摇床培养至OD₆₀₀ =1.2（大约5小时）。

1)  保菌：在超净台台中取菌液和甘油相同体积于冻存管（使甘油终浓度在20%~30%之间，例如0.5 mL菌液+0.5 mL 60%甘油），混匀后放入-80 °C冰箱中保存。

2)  对照：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，不加诱导剂，16 °C摇床中诱导约3小时。

3)  诱导：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，加入适量诱导剂（常为1 μL 1 M IPTG，其他诱导剂用量请参见其使用说明书），16 °C摇床中诱导约3小时。

3.   SDS-PAGE检测

1)   诱导组和对照组的菌液，5000 rpm离心5 min，弃上清（此时可以打开煮样器，让其升温）。

2)   每管加入100 μL ddH₂O重悬，并加入SDS-loading至1×，混匀，煮样器中煮10~20 min。

3)   12000 rpm离心10 min（此时可以将蛋白电泳装置准备好）。

4)   将离心好的样品取上清按照未诱导、诱导、未诱的方式对应跑胶。

5)   对成功诱导的克隆进行-80 °C冰箱甘油保存。

1.  尽量不要在冰箱中冻存过多的表达/克隆菌，节约公共资源。

2.   实验室常用的抗生素有Kan和Amp，具体抗性视载体情况而定，例如V28E、V29H等载体抗Kan，V55、V137、V138等载体抗Amp；并不是所有载体都用IPTG诱导，使用前需要查看相关说明书。

3.   若重复若干次实验，目的蛋白的小规模表达均不理想，可以考虑更换载体或表达菌株再进行小规模诱导检测；

4.   若想确定蛋白表达是在包涵体中还是上清，可以从诱导成功的冻存菌中再接种表达菌进行诱导表达，诱导结束后离心菌液取沉淀，加入缓冲液后进行超声破碎，再次离心分别取上清液和沉淀制样，通过SDS-PAGE检测以确定表达的情况。

5.   对于一些特殊性质或较难表达的蛋白，可尝试不同的表达菌株，例如AI可用于表达毒性蛋白，Rosetta、RIP、RIPL常用于表达哺乳动物蛋白（含有稀有密码子）。

3.1.1.2 E. coli大规模蛋白表达

r  试剂（REAGENTS）

LB培养基、抗生素（根据载体抗性而定）、1 M IPTG、50%葡萄糖、2 M MgSO₄

r  实验前准备（SETUP）

清洗2 L的摇菌烧瓶；清洗若干个50 mL离心管（灭菌后用于接菌）

r  器械（EQUIPMENT）

摇床、超净台、高压灭菌锅

1.  配制LB：在大规模摇菌前一天配制LB，以5升LB培养基为例：称取50 g NaCl、50 g 蛋白胨、25 g 酵母粉溶于自来水定容至5 L。同时配制用于第二天大规模接菌的LB培养基：称取2.5 g LURIA BROTH（Miller’s LB Broth）溶于100 mL纯水的烧瓶中。将上述LB培养基、50 mL干净离心管、50%葡萄糖、2 M MgSO4于高压灭菌锅121 °C灭菌20 min。

2.  在超净工作台中将小规模诱导成功的表达菌接种于100 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素，同时也可每升可添加1 ml 2M MgSO₄和5 ml 50%无菌葡萄糖（促进细胞生长，抑制基础/漏表达），37 °C摇床内过夜摇菌。

3.  UV灭菌：在第二天大规模摇菌前打开大摇床的UV照射灭菌，同时将LB、灭菌后离心管、抗生素及所需枪头喷洒酒精后放入超净台内，打开UV照射灭菌20 min。

4.  接菌：用无菌50 mL离心管将过夜培养的菌液平分至5升LB中，并加入相应抗生素。

5.  摇菌：37 °C摇床内大规模摇菌至OD₆₀₀值为1.2（约需3~4小时），然后调节温度至16 °C，加IPTG诱导表达4 h后于4 °C落地离心机收菌，-80 °C冷藏。

1.  尽量不要使用甘油冻存菌直接接菌，建议重新划线LB平板然后挑取单克隆，以避免噬菌体污染和质粒丢失；

2.  根据蛋白表达量确定大规模摇菌体积，如果表达量很高的蛋白一般3 L足够，而表达量低的蛋白可多摇至10或12 L，一般情况下，我们需要纯化得到几毫克的蛋白用于结晶及后续相关实验用。

3.  由于大摇床降温速度较慢，提前开始降温至16 °C，冷却1 h后再加入IPTG；诱导时间一般4小时足够，具体诱导时间长短，以获得最终有活性非聚合蛋白的量为准，诱导时间过长可能包涵体或聚合体产量大，也有可能发生蛋白降解。

4.  收菌前吸取300 μL菌液制备SDS-PAGE样品，纯化之前先鉴定蛋白表达与否。

5.  诱导的条件，比如时间和温度，可以根据需要进一步优化。

3.1.1.3蛋白纯化

r  试剂（REAGENTS）

Ni-Binding buffer：0.50 M NaCl，16 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0

Elution buffer：0.50 M NaCl，400 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0

Gel filtration buffer：0.25 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0

r  实验前准备（SETUP）

buffer使用前在放在4 °C冰箱预冷，准备收集管，保证有足够的干净且已烘干的玻璃管

r  器械（EQUIPMENT）

Thermo落地式离心机（使用前预冷至4 °C），AKTA FPLC纯化仪，超声仪，抽滤泵

A.        纯化蛋白——一次Ni亲和柱

►       破菌 ►预计消耗时间：30 min~1 h

1.  将冻存在-80 °C冰箱的菌拿出来，放在水里解冻，根据细菌湿重每克5~10 mL加入Ni-Binding buffer。解冻后把金属烧杯放在冰上，进行超声。对于不稳定的蛋白，可加入PMSF以防止蛋白降解。

2.   将烧杯至于冰水中进行超声破碎。液流不呈丝状时，说明已超声完全。

3.  用完后用水洗探头。

▲ 关键步骤：

♫  观察蛋白质纯化过程中蛋白质的降解和沉淀情况，当蛋白易降解时，可在所有缓冲液及蛋白收集。液中加入通用丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF，终浓度0.5 mM）抑制蛋白降解。

►       离心、过滤 ►预计消耗时间：40 min

1. 将超声好的菌液平均倒入离心管中，配平好，放入已预冷至4 °C的落地式离心机。

2. 14000 rpm 离心20分钟，将上清倒入小烧杯中。

3.  组装好抽滤装置进行抽滤（注意不要漏，样品和滤瓶均要放在冰上）。

►       平衡Ni-NTA柱 ►预计消耗时间：20 min

1.  将Ni柱从4 °C冰箱取出，这时柱里面是20%酒精。

2.  限压0.4 Mpa，流速3 mL/min，水洗Ni柱10分钟。

3.  换成Ni-Binding buffer再洗10分钟，将Ni柱平衡好。

►       上样使蛋白挂柱 ►预计消耗时间：根据样品体积而定

1.  将Super loop和Ni柱都放在冰上，用洗好的绿色的连接管湿接Ni柱。

2.  蠕动泵流速设定为3 mL/min，限压为0.4 MPa。

3.  当样品流完一个柱体积时，用Ep管接流出的样品，标记好“first flow through”。

4.  当样品快流完时，用Ep管接流出的样品，标记好“last flow through”，用于后续检测。

▲关键步骤：

♫  样品体积小时可以减速，使样品充分与Ni2+进行反应，能挂柱的都挂上

♫  第一次纯化某蛋白时，建议收集流出液，避免蛋白不挂柱损失蛋白（注意避免气泡进入柱子）

►   洗脱目的蛋白 ►预计消耗时间：40 min

1. 提前将AKTA的A，B泵用水进行system wash。再用buffer，即A泵用Ni-Binding buffer，B泵用Elution buffer进行system wash。

2.  将系统流速设置1 mL/min，manual run时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。

3.   调程序（以AKTA Prime为例）：设置3 mL/min，0.4 MPa，Load。

4.  程序跑完后，将结果保存至自己的文件夹中，写明日期、样品名、程序类型（Ni柱洗脱还是分子筛等）。

5.  在图谱中与目的蛋白的峰对应的样品收集到一个干净的50 mL离心管，取40 μL至Ep管中，标记好“Ni elution”，与前面的样品以及跑蛋白电泳，检测纯化效果。

6.  AKTA的A，B泵用水进行system wash。

7.   将用完的收集管用自来水冲5遍，用蒸馏水冲3遍后，晾在试管架上。

8.  用完的Ni柱要进行清洗和重灌镍，详见附录的“柱子型号、特点及清洁方法”。

▲关键步骤：

♫ 注意Ni柱上游的连接管中不要残留不明液体，以免影响纯化效果。

♫ 在多次使用后Ni柱变为白色或灰色时，则需要重新灌填料，以免造成柱子与Ni亲和力差从而影响蛋白纯化。

♫  柱子使用完毕后清洗并用灌以20%乙醇储存。

►       TEV酶切 ►预计消耗时间：12~16 h

1.  根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，测OD₂₈₀值。

2.  根据OD₂₈₀计算并加入相应体积的TEV蛋白酶，同时加入2 mM DTT、1 mM EDTA（终浓度），过夜酶切。

▲关键步骤：

♫ 建议使用TEV和目的蛋白摩尔比例为1：10放置在四度冰箱过夜酶切。

♫  高盐能够抑制TEV 蛋白酶的活性，因此TEV酶切时尽量控制盐浓度小于0.5M。

♫  TEV消化后，由于DTT和EDTA的原因，需要透析或凝胶过滤才能进行二次Ni纯化。

♫  在使用TEV酶切蛋白时，需要蛋白透析buffer中存在DTT，因此最好不要一边透析一边酶切，酶切和透析分开来做，这样有助于实现良好的酶切效果。

B.  纯化蛋白——大分子筛

►       样品准备 ►预计消耗时间：20 min

1. 实验室有120 mL、320 mL等规格的大分子筛（详见3.2.2 蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法），根据洗脱蛋白体积及蛋白性质选择分子筛类型（蛋白洗脱体积要小于分子筛柱体积的1/10）。

2.  倒入高速离心管中，放入已预冷至4 °C的落地式离心机中，14000 rpm离心15分钟。

3.  小心倒入干净的50 mL离心管中，放置在冰上。

4. 用注射器将样品打入Super loop，避免气泡。

5. Super loop连接至AKTA，可以manual run 0.5 mL/min，接好后stop。

▲关键步骤：

♫ 分子筛非常忌讳进气泡，连接时、样品打入Super loop时避免气泡

♫  过分子筛前样品要离心或者过滤，避免沉淀进入分子筛造成堵塞

►       过分子筛 ►预计消耗时间：4 ~ 5小时

1.  不同的分子量的样品出峰的时间不同，下面以30 mL体积样品，分子量为55 kDa，用AKTA Prime纯化仪来过400 mL柱子为例，设定程序：

▲ 注：程序可以根据实际情况修改

2.  把收集的流出管放在第一个收集管上，分子筛一般会有很多个收集管，如果不从第一管开始的话也可以通过简单计算来确定对应峰的管号。

▲关键步骤：

Ÿ   若是第一次过分子筛，可早些收样，以免错过样品峰

►       收集样品、检测纯度 ►预计消耗时间：1.5小时

1. 将目的蛋白峰所对应的收集管中蛋白倒入干净的50 mL离心管中，放在冰上，并加入5 mM DTT，2 mM EDTA，0.5 mM PMSF（终浓度）。如果要续过二次镍柱，则不需加DTT、EDTA。

2.  取40 μL至Ep管中，标记“gel filtration”来用SDS-PAGE检测样品纯度。

►       分子筛清洗 ►预计消耗时间：8小时

1. 每次用完要用水洗一个柱体积，用20%酒精罐一个柱体积。每用完5次，水洗一个柱体积后，用0.2 M NaOH清洗一个柱体积，再用水清洗3个柱体积，最后用20%酒精罐一个柱体积。详见附录中的“柱子型号、特点及清洁方法”。

2. 清洗完分子筛之后，在标签纸上写明日期、使用者、目前柱子里罐的是什么溶液，方便管理，并且也方便后面的人使用。

▲关键步骤：

♫氢氧化钠要放在塑料瓶中，因为玻璃瓶中的硅酸盐会被碱性的氢氧化钠所腐蚀，成为硅酸钠，因此碱性物质一定不能放在玻璃瓶中。

♫ 清洗及使用分子筛时注意设置限压，不能超过最大压力，否则会破坏分子筛。

C.  纯化蛋白——二次Ni亲和柱

►       平衡Ni-NTA柱（同上） ►预计消耗时间：20 min

►       湿接Ni柱 ►预计消耗时间：10 min

1.提前将AKTA的A，B泵用水进行system wash。再用buffer，即A泵用Ni-Binding buffer（也可用GF buffer），B泵用Elution buffer进行system wash。

2. 将系统流速设置1 mL/min，manual run时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。

3.  调程序（以AKTA Prime为例）：设置3 mL/min，0.4 MPa，Load。

4.  使用A冲洗已接好的Ni柱至UV线齐平。

►       样品准备 ►预计消耗时间：20 min

1.  根据峰图和SDS-PAGE收集目的蛋白，倒入高速离心管中，放入已预冷至4 °C的落地式离心机中，14000 rpm离心15分钟。

2.  小心倒入干净的50 mL离心管中，放置在冰上。

3.  用注射器将样品打入Super loop，避免气泡（上样体积一定要小于柱体积的10%）。

4.  Super loop连接至AKTA，可以manual run 3 mL/min，接好后stop。

▲ 关键步骤：

♫  在纯化的每一步都要进行SDS-PAGE，以鉴定目的蛋白的存在及其纯度。

♫   连接时、样品打入Super loop时避免气泡。

►     开始程序 ►预计消耗时间：40 min

▲关键步骤：

Ÿ   大多数蛋白在TEV切掉MBP后不会挂Ni先被洗脱下来，而MBP因含有His tag则会在拉B梯度时才会被洗脱下来，从而达到目的蛋白与MBP分离的目的。不同蛋白性质不同，为保险起见，应从开始程序到结束程序都要进行收集。

Ÿ   有部分蛋白由于其表面有组氨酸和谷氨酸残基簇，可能对Ni柱具有较高亲和力，在洗脱阶段才能被洗脱。这种情况，建议采用gel filtration buffer作为其binding buffer。

Ÿ   在洗脱时建议采用比第一次镍柱更缓和的梯度，便于提高洗脱分辨率。

D. 纯化蛋白—— 24 mL分子筛

►       平衡分子筛 ►预计消耗时间：2~3小时

►       开始程序 ►预计消耗时间：30~40 min

1. 将样品4 °C离心机高速离心15 min。

2.   根据样品体积选择合适的loop（0.5/1/2 mL），一般需要选取至少两倍样品体积的loop（比如0.5 mL样品用1 mL loop，1 mL 样品用2 mL loop）。

3.  先用水冲洗三次自动上样环，然后再用GF buffer冲洗3次。

4.  用注射器将蛋白样品打入自动上样环中（注意不要进气泡）。

5.   这里以1 mL loop为例，设定程序：

▲ 关键步骤：

Ÿ   一般24 mL分子筛用于分析蛋白聚合情况，且蛋白质非常容易使分子筛堵塞，尤其是24 mL高分辨率分子筛，上样量要小于10 mg，体积小于1.0 mL。

Ÿ   上样前样品需要4 °C高速离心。

Marker实例：

Bio-Rad蛋白质量标准24 mL分子筛图谱。

►       蛋白保存 ►预计消耗时间：15 min

1. 根据2nd Ni后SDS-PAGE图，来判断接下来是否还需要进一步纯化。如果目的蛋白存在较多杂蛋白，可进一步查阅相关文献了解蛋白性质，然后进一步纯化（疏水柱、离子交换柱等，详见3.2蛋白纯化技术章节）；如果目的蛋白条带单一纯度较高，则可测量蛋白浓度并进一步浓缩后于-80 °C冰箱内存放。

2. 蛋白浓度计算公式

▲  关键步骤：

♫  蛋白样品采用小体积冷冻（20~200 μL），“速冻速溶”——直接放入- 80 °C冰箱中存放，解冻蛋白时将Ep管握在手中快速解冻，以减少对蛋白的伤害。

♫   OD280测量值一般在0.2~0.8较为准确，若蛋白浓度过高，可稀释后再进行测量。

♫   测量蛋白质浓度后在保存管上标记清楚。

♫   将蛋白质浓缩到尽可能高的浓度以便结晶。

♫   尽量避免经常冻融蛋白质样本。

1.   蛋白质要尽可能保存在冰上，或者4 °C冰箱中。

2.   提前计划好实验流程，预约摇床、AKTA、平衡分子筛等。

3.   浓缩蛋白质时选择合适的浓缩管，应选择截留小于蛋白质分子量一半的浓缩管。

4.   选用合适的分子筛色谱柱。GE公司的24 mL 10/300 GL 柱型是分析型分子筛，适合对少量蛋白进行分离和鉴定聚合程度。载量建议在5 mg 以内，体积在1 mL以内。Superdex-75适用于5~15 kDa蛋白的分离，而Superdex-200适用于15~100 kDa蛋白的分离，Superdex-300或者Superose-6适用于大于100 kDa的蛋白分离。

5.    为防止蛋白降解，大多数蛋白样品中要添加EDTA和DTT，但是当需要过Ni柱的样品中不能有EDTA和DTT，EDTA是金属螯合剂，它可以把Ni离子从柱子上洗下来，DTT是还原剂，它可以把Ni离子还原成棕色的物质，影响纯化效果。

6.    不同的蛋白质性质不同，在纯化前尽可能多地了解蛋白质性质，包括PI、缓冲体系、潜在的配体，及相互作用蛋白等；一般纯化蛋白用到的buffer的pH值要远离蛋白等电点。

7.    不同的溶解度在pH值、离子强度、温度等方面有很大的不同，当蛋白质在标准条件（如0.25 M NaCl，20 mM Tris-HCl pH 8.0）纯化过程中形成沉淀时，可尝试提高盐浓度、调整pH值、或添加一些稳定剂（2-10%甘油，20-100 mM精氨酸）等方法，试着找到一个易于纯化、结晶的条件。

8.    对于蛋白质交联等无胺缓冲系统，可采用磷酸盐、HEPES等缓冲液。

9.     如果蛋白样品用于圆二色谱实验，需要把缓冲液换成磷酸盐以及低盐体系，降低背景。

10.   如果蛋白样品用于结晶，尽量选用低盐、低缓冲液的buffer，比如纯水，100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0。

r  试剂（REAGENTS）

转染试剂PEI：称取0.05 g PEI粉末倒入45 mL超纯水中，利用磁力搅拌。加入12 M盐酸调节pH至小于2，室温搅拌3 h以上至PEI彻底溶解。加入10 M NaOH溶液调节pH至6.9~7.1，加水定容至50 mL。采用0.22 μm针头滤器过滤除菌。分装500 μL/管，-20 °C可以储存1年，解冻后放在4 °C可保存2星期，不能解冻后再复冻。

细胞培养试剂：高糖DMEM、FBS、P/S双抗。

Running buffer：0.15 M NaCl，20 mM Na₂HPO₄ pH 7.0。

0.1 M乙酸：取2.874 mL冰醋酸加入500 mL ddH₂O并混均。

1 M Tris-HCl pH 8.0。

Protein A纯化柱。

r  实验前准备（SETUP）

配置好以上所有试剂，观察CO₂是否充足。复苏HEK293T细胞并培养至第二代。抽提无内毒素表达载体质粒。

r  器械（EQUIPMENT）

超净工作台、离心机、蠕动泵、AKTA纯化仪。

1.  培养细胞

1)  提前18~24 h接种适量的HEK293T细胞（约1.5×10⁶/皿）至100 mm培养皿，每个皿加入10 mL DMEM+10% FBS培养。

2)   当细胞融合达到90%左右时，即可进行转染实验。

2.  转染和表达

1)  预热高糖DMEM。

2)   取1根1.5 mL离心管，加入0.5 mL高糖DMEM，再加入8 μg转染的质粒（无内毒素），吹打混匀，命名为溶液1。

3)   取1根1.5 mL离心管，加入0.5 mL高糖DMEM，再加入32 μL PEI试剂（1 mg/mL），吹打混匀，命名为溶液2。

4)   将溶液1加入溶液2，吹打混匀，命名为溶液3。

5)    室温孵育15 min。

6)    滴加1 mL以上溶液3至1皿（悬空逐滴滴到皿的各处），将培养皿前后左右各shake 10次以混匀。

7)    放置培养皿至细胞培养箱培养48~72 h，从培养24 h后开始，每隔12 h收集上清并换液一次。上清中加入终浓度为2 mM EDTA混匀后于4°C储存。

3.  纯化

1)   将收集的培养基上清5000 g、4 °C离心10 min，采用0.45 μm滤膜过滤。

2)   1:2将培养基上清稀释至Running buffer中。测量pH值应为6.0~7.0之间，冰面放置。

3)    使用5 个柱体积的Running buffer平衡Protein A柱子。

4)    将培养基上清稀释液过柱上样，流速设置为4 mL/min。

5)   连接AKTA纯化仪，使用10个C.V.的Running buffer以流速为3 mL/min洗柱，直到OD₂₈₀达到基线。

6)    使用0.1 M乙酸（pH 3.0~4.5）以3 mL/min流速进行梯度洗脱，梯度从0~100%，洗脱体积为30 mL。每管收集1 mL，每个收集管中加入0.2 mL 1 M Tris（pH 8.0）以中和其酸性。

7)    继续采用4个柱体积的100% 0.1M乙酸洗柱。

8)   用10个柱体积的水洗柱，然后过2个柱体积的20%乙醇，柱子存放于4 °C。

▲        关键步骤：转染质粒前，细胞的生长状态一定要好。

附：实例结果

从3块150 mm培养皿的HEK293T细胞上清中纯化hTIGIT-TEV-Fc的层析图

针对性建议（TROUBLESHOOTING）

1. 以上步骤中的细胞量及转染试剂量可以按比例缩小或放大。通常一次表达至少需要3个100 mm培养皿。

2.  通常GE公司的1 mL Protein A beads可以结合约20 mg IgG1蛋白。

3.  哺乳动物细胞表达蛋白的量通常较低，不同的蛋白表达量又会不尽相同，如果蛋白表达量高，3个100 mm培养皿的细胞培养上清中可以纯化得到约0.5 mg蛋白。

r  试剂（REAGENTS）

昆虫培养基、LB、卡那霉素、庆大霉素、四环素

SIM SF培养基（实验室现用）：无血清即用型培养基，无需任何添加成分或加血清。然而加2%血清会减少感染过程中蛋白水解量。其优点：1）降低昂贵的血清成本；2）简化分泌重组蛋白纯化过程；3）消除血清组织敏感性。

r  实验前准备（SETUP）

配置液体LB、配置固体LB平板、配制昆虫培养基

r  器械（EQUIPMENT）

Thermo离心机、摇床、培养箱、培养皿、培养瓶、冻存管、移液管

►       制备感受态（DH10Bac）

1.  将DH10Bac加入20 mL LB培养基中（含有50 µg/mL卡那霉素和10 µg/mL四环素）培养过夜，再将培养物接种到500 mL LB培养基（含有卡那霉素和四环素）震荡使OD值达到0.6~0.8。

2.   3000 rpm，4 °C离心15 min，用100 mL 50 mM CaCl₂重悬，混合均匀后3000 rpm，4 °C离心15 min。

3.  重复用100 mL 50 mM CaCl₂重悬，冰上静置30 min后3000 rpm，4 °C离心15 min。

4.  最后使用20 mL CaCl₂ +15% glycerol重悬，分装至无菌的1.5 mL EP管中-80 °C保存。

►       质粒转化

1.  从冰箱中拿出一管100 μL的DH10Bac感受态细胞（DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性，而供体质粒pFastbac含有庆大霉素的抗性，所以在制备DH10Bac感受态细胞时需要在培养时添加卡那霉素和四环素，而在制备杆粒时需要使用卡那霉素，四环素，庆大霉素的三抗平板。）加入1~2 µg的质粒混匀，放在冰上静置30 min。

2.  拿入42 °C热激45~90 s，立即放于冰上冷却2 min，加入500 μL无抗性的LB，置于37 °C摇床中225 rpm震荡2~4 h。

3.   涂板（三抗的板子，50 µg/mL卡那霉素，7 µg/mL庆大霉素，10 µg/mL四环霉素，100 µg/mL X-gal，40 µg/mL IPTG），闭光正置于37 °C培养箱中培养至少48 h。

4.  挑选白色的菌落，如果有需要将白色的菌落重新挑到三抗的板子划线，培养至少48 h。

5.  接着挑取白色单克隆至含有5~10 mL的LB（含有7 µg/mL庆大霉素）管中，过夜摇菌后保种放于-80 °C，剩余菌液可以提取Bacmid。

►       Bacmid的提取

因为Bacmid大于130 kb，质粒抽提不能使用如上述的膜吸附抽提，而要采用传统的乙醇沉淀法。

1. 准备试剂

Buffer I：25 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM葡萄糖，10 mM EDTA；

Buffer II：0.2 M NaOH，1% SDS（w/v）；

Buffer III：3 M KAc，2 M HAc。

2.  将震荡培养的菌液 5 mL离心，弃上清，留下大肠杆菌菌体。

3.  加入250 μL提前加入RNase A 的Buffer I，重悬细菌。

4.  加入250 μL Buffer II，温和充分颠倒4~6次至形成透亮的溶液。

5. 加入350 μL Buffer III，温和颠倒6~8次，13400 rpm离心5~8 min。

6.  将上清转移到洁净灭菌的1.5 mL EP管中，13400 rpm离心5~8 min。

7.  转移上清到洁净灭菌的1.5 mL EP管中，加入等倍体积的异丙醇，冰上放置20 min。

8.  13400 rpm，于4 °C离心10 min，小心移除上清，注意不要吸走白色沉淀或者油状物。

9.   加入1 mL -40 °C预冷的70%乙醇，颠倒混匀后13400 rpm 4 °C离心1~10 min，弃除乙醇，留下白色沉淀，此步骤可重复一次进一步减少杂质。

10. 开盖在干净通风处放置5~20 min至乙醇完成挥发。

11. 加入30 μL预热的ddH₂O，充分溶解质粒，测浓度，用于后续实验。

►       Bacmid转染（获得P1代病毒）

1. 将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×10⁶，静置15 min让细胞贴壁，轻轻摇动培养板观察到大部分细胞不晃动即可。

2. 取两个1.5 mL EP管分别命名为转染试剂和Bacmid，每管加入100 μL培养基，抽到的Bacmid取4 µg加入到Bacmid管，转染试剂管中加入相应量的转染试剂，静置30 min，再将两管混合孵育30 min。

3. 将混合物滴入到SF9细胞中。

4.  培养皿放于27 °C静置培养5~7 h后更换新鲜培养基继续在27 °C培养66~72 h。

5.  当大多数细胞变圆变肿后收集用1500 rpm, 4 °C避光离心10 min收集上清病毒，可用0.22 µm的滤膜过滤，即获得P1代病毒。

►       病毒感染

1.  同上步，将准备好的SF9细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×10⁶，但不需要静置使其贴壁。

2.  将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27 °C摇床中培养3~7天。

3.   800 rpm离心5 min取上清，可用0.22 µm的滤膜过滤，即获得P2代病毒。

4.   重复上述步骤扩增病毒即可获得P3、P4代病毒，在扩增获得P4代病毒时，可以扩大细胞体积，采用50 mL细胞，细胞密度不变（若P4代病毒感染细胞表达蛋白水平不理想，可继续扩增）。

5.   获得P1代病毒后，需要对病毒感染细胞表达蛋白的能力进行检测。

6.   将准备好的Hi5细胞分到一个6孔培养板中，体积为2 mL，密度为1×10⁶。

7.   将P1代病毒以病毒：细胞1：100的比例加入6孔板中，避光在27 °C摇床中培养72 h，检测蛋白表达情况；

8.   获得P4代病毒后，可对病毒：细胞比例设计梯度（例如1：10~1：100000）进行蛋白表达量检测，步骤同4，寻找合适比例用于后续大规模蛋白表达。

9.   寻找合适比例后，可进行大规模蛋白表达，Hi5细胞体积可改为50 mL、500 mL、1 L逐步增多，密度同为1×10⁶，按比例加入P4代病毒后，在27 °C摇床中培养3天，即可进行蛋白纯化。

►       分泌蛋白沉淀法

1.  将1 L细胞常温2000 rpm离心15 min，收集1 L的上清，加入沉淀剂，1 mL 1 M NiCl₂（终浓度1 mM NiCl₂），1 mL 5 M CaCl₂（终浓度5 mM CaCl₂），50 mL 1 M Tris pH 8.0 （终浓度50 mM Tris pH 8.0）。

2.  加入转子搅拌，会有大量白色沉淀出现。

3.   将这1 L溶液常温6000 rpm离心15 min。

4.    收集上清，0.2 μm滤膜抽滤。

5.   将0.2 μm滤膜抽滤后的上清加入2 mL Nickel beads，室温搅拌3小时以上。

6.   收集Nickel beads，用咪唑洗脱蛋白。

►       SF9细胞的冻存

1.  在150×25 mm的培养皿中，25 mL培养基中生长细胞，当细胞密度大于90%时培养基使用1000 rpm离心10 min，然后用6 mL冻存剂重悬（10% DMSO，90% FBS），吸取1 mL放于冻存管中。

2.   将冻存管放于冻存盒，冻存盒依次放于-20 °C冰箱6 h，-80 °C冰箱24 h，液氮罐。

►       SF9细胞的复苏

1.   准备SF9培养基：在27~30 °C预热。

2.  从液氮中拿出需要复苏的细胞，迅速放到27 °C水浴中快速摇晃解冻，转移至15 mL离心管中，加入10 mL培养基，1000 rpm离心5分钟，移除上清，加入3 mL培养基，使用移液枪慢慢吹吸三次后转移到60×15 mm培养皿中（依据细胞的量选择培养皿）。

3.   显微镜下检查细胞状态，当大多数细胞贴壁后更换新鲜培养基，将培养皿放到27 °C培养箱中培养至少24 h。

4.   24 h后细胞密度大于80%可以分皿培养，少于80%需要继续更换新鲜培养基培养。

►       SF9细胞的传代培养

1.   SF9细胞培养在10~15 mL培养基中每代培养2~3天，当密度达到2×10⁶ 即可传代，避免超过5×10⁶，影响细胞状态。

2.   预热培养基，室温放置1小时。

3.   准备已培养2~3天的SF9细胞和一个新的锥形瓶，对SF9细胞进行计数，计算其密度。

4.  根据密度吸取一定量的新鲜培养基与SF9细胞至新锥形瓶中，总体积10 mL或可根据需要增大体积，终密度为0.5×10⁶。

►       Hi5细胞的传代培养

操作同SF9，不同的是Hi5生长速度较快，每代培养1~2天即可传代。

针对性建议（TROUBLESHOOTING）

1.  冻存（昆虫细胞冻于液氮中，确保细胞处于对数期）。

2.   Hi5细胞的冻存与复苏和SF9细胞一样，但50 mL的Hi5细胞可以冻存10~20管。

3.   Hi5培养条件是250 mL培养瓶，30~40 mL培养基，在27 °C条件下100 rpm振荡培养，每两天传一次代。

4.   在扩增病毒时，可在SIM SF培养基中加入10%血清。

r  试剂（REAGENTS）

B834、LB培养基、M9培养基、MediumA培养基、抗生素、硒代甲硫氨酸、IPTG

r  实验前准备（SETUP）

收菌瓶要提前高压灭菌，烘干，预冷。

1.   将重组质粒转化表达菌株B834（DE3）感受态细胞，涂板，37 °C过夜培养。

2.    第二天，挑单克隆到5 mL LB中，37 °C摇过夜。

3.   第三天，将过夜菌全部加到1 L LB中，在37 °C摇床中摇到OD₆₀₀达到1.0~1.5。

4.   将菌液3700 g，4 °C离心10 min，弃上清，收菌瓶要提前灭菌，并放烘箱烘干，再放4 °C预冷。

5.   加入20 mL Medium A培养基温和重悬菌液，此操作是为了洗去菌液表面残留的LB培养基，使细菌更快适应新的培养基，也避免丰富培养基中甲硫氨酸影响硒代效果。将菌液加入现配的等体积硒代培养基Medium A中（不含任何甲硫氨酸）；在37 °C摇床中摇 4~8 h至 OD₆₀₀=1.5。

6.   加1 mL 50 mg/mL硒代甲硫氨酸，37 °C 生长30 min。

7.   向菌液中加入IPTG诱导, IPTG终浓度为0.25 mM，4 h×37 °C or 20 h×16 °C。

8.    4000 rpm，4 °C，15 min收菌，弃上清。将菌体用样品匙取出，加少量裂解液润洗离心瓶后冻-80 °C冰箱。

AKTA介绍菜单

安全（Safety）、组件（Components）、方法编程（Method programming）、使用方法（Usage）、维护注意事项（Maintenance）、针对性意见（Trouble shooting）、使用规则（Rules）

►       安全(Safety)

►      

组件（Components）

Ÿ   缓冲液阀和梯度转换阀（Buffer valve and gradient switch valve）：缓冲液阀用于选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度转换阀用于建立梯度。

Ÿ   系统泵（System pump）：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度转换阀或经上样阀进入流动通道。

Ÿ   压力传感器（Pressure sensor）：压力传感器可以测量在位液体压力。还可用作压力保护装置。

Ÿ   混合器（Mixer）：混合器用于混合两元梯度。以两步将溶液混合以得到最适宜的结果。混合器的体积可以选择。

Ÿ   上样阀（Injection valve）：上样阀用于装加样环和用于将样品注射到柱上。

Ÿ   检测器（Monitor）：检测器的目的是测量流出柱后液体的UV吸收、电导率和pH（任选）。用于这些测量的流动池安装在系统的右侧。

Ÿ   具有分流阀的分部收集器（Fraction collector with flow diversion valve）：分部收集器用于将样品组分收集在管中供进一步分析。分流阀在废液和收集管之间转换流向。

►       方法编程（Method programming）

►       使用方法（Usage）

1. 打开AKTA （机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲洗干净分别插入到Ni-Binding buffer和Elution buffer中，并在Template中选择system wash，洗泵（大概五分钟）。

2. system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=1 mL/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样可以防止绿色线管扭曲），观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。

3.  设定程序：流速3 mL/min，limit pressure为0.4 MPa

4.  蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下一位使用者，将A泵和B泵泵头用蒸馏水冲洗干净后放入蒸馏水中，并在Template中选择system wash，洗A、B泵。用蒸馏水清洗完毕后如果长期不用机器，需要用20%酒精再次清洗系统泵。并将收集器上的玻璃管收拾干净，并用水清洗，放于管架晾干。

5.  蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面打开prime view evaluation软件，打来文件夹，在里面按照时间顺序找到你蛋白质纯化图谱，然后点击file，选择save as将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export → curves → 选择01：UV和06：Conc → 并在Reduce number of samples中选择Reduce by 1。点击保存，得到excel 表格，并用Graphpad prism5做蛋白纯化图谱（有视频教学）。

▲  关键步骤：

♫   提前看好转盘与滴液体的部分是否靠紧，否则不会自动收集样品。

♫   根据出峰位置选择样品，一般会有30 mL左右，加入终浓度1 mM EDTA和2 mM DTT以及0.5 mM PMSF，取60 μL制备SDS-PAGE样品。

1.打开AKTA，将A泵用gel filtration buffer清洗（同上文镍柱清洗）。并用gel filtration buffer手动或者程序设定清洗上样环。

2. system wash完毕后，先选择manual run，%B=0，pressure limitation=0.4 MPa，流速=2 mL/min(根据不同分子筛设定流速）。先将AKTA上1号接线口湿接上部分子筛，此时观察柱子管道是否有气泡，如果有气泡那么应该将1号接口线湿接到分子筛尾部接口，待分子筛头部管道空气排清后再正过来接柱子，最后将柱子尾部接口接到探测器上。观察电脑屏幕待UV线、电导线平齐时End program。

3.  Super loop接上，6号出口线接super loop上面，下面出来接上2号口。

4. 设定程序（以30 mL样品和320 mL分子筛为例）：

5.  蛋白纯化结束后，要清洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵用蒸馏水冲洗干净插入到蒸馏水中，并在Template中选择system wash，洗泵。

6.   蛋白质纯化图谱的保存与提取：同上文镍柱部分。

▲关键步骤：

♫   分子筛应当在使用前处理干净并且用对应的buffer平衡至少1.5个柱床体积。

♫   柱子连接纯化仪时，应该尽量敢走柱子进样管中的气泡（可以通过反向连接柱子，赶走进样管的气泡）。

♫   接Super loop时先将上端连接inject valve 2号孔后，在manual run中设pathway 为inject，待super loop下端绿色连接管中气泡被赶出后，再接入inject valve 6号孔。

♫    Super loop中的样品如果只有A mL，在设定程序时需要有所保留设定为A-1 mL，以免气泡进到柱子里。

AKTA Pure 纯化系统

ÄKTA™ pure 是一台灵活直观的层析系统，可用于快速纯化从微克到克水平的蛋白、肽和核酸等目标产物。同时ÄKTA™pure也是一台可靠的系统，它的硬件以及Unicorn软件与各种层析柱和填料仪器可满足任何纯化挑战。系统支持各种层析技术，并满足需要提供最高纯度的自动化要求。系统配置灵活，并可以根据您的需要随时升级，进一步提高其性能。

►       方法编程（Method programming)

Method Editor

1.  在file中打开new,会出现Method setting, Equilibration, Sample Application, Elution。在Method setting中主要设置一些基本参数，如柱子类型，体积，流速，压力，Method Bass Unit等。

2.  Equilibration这一选项主要是用Buffer平衡柱子，在the total volume is__可以选择平衡柱子的体积。把里面一些杂蛋白洗掉。

3.  Sample Application可以选择Super loop体积大小（我们实验室有50和150 mL的Superloop)和Sample volume上样体积,并且可以改变InIet B的百分比。

4. Elution中的Gradient elution在Type中选择linear,并选择target %B和length（mL）。程序设定结束后，点击保存。可以保存在System Control。

1.  在System Control中选择Manual用于清洗纯化仪内部管道及泵，具体操作分别点击Pumb A wash和Pumb B wash，选择On，再点击Execute。

2.  在System Control中选择你保存的程序，点击Start.程序就可以运行了，但是在运行前要先清洗泵。程序运行完毕后，点击保存，程序会保存在Evaluation classic。

1.   在Evaluation Classic中找你运行后的纯化图谱，保存和提取。   

2.  在Evaluation Classic中提取纯化图谱，点击File--Curves--Cond and UV，并选择Select，Export。

►       方法编程（Method programming)

Method Editor

1. 一般拷贝已有的程序，然后根据自己的需要进行更改。打开文件夹，选择需要拷贝的程序，右键copy，然后选择自己的文件夹，点击OK，拷贝成功。

1. 在System Control中选择Manual用于清洗纯化仪内部管道及泵，具体操作分别点击Pumb B wash和Pumb A wash，选择On，再点击Execute。

2.  在System Control中选择你保存的程序，并选择保存路径，点击Start，程序就可以运行了，但是在运行前要先清洗泵。程序运行完毕后，程序会保存在Evaluation classic。

1. 在Evaluation Classic中找你运行后的纯化图谱，保存和提取。数据在拷贝后，会出现部分数据丢失的现象，若用于文章作图，建议选择其他纯化仪。

2. 在Evaluation Classic中提取纯化图谱，点击File—Export—Curve，选择UV1_280 and Conc, Reduce by factor调到1，Select到Curves to export, Export.文件类型选择.xls。

►       维护注意事项（Maintenance )

1. 除了连续使用外，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存在装载缓冲液状态过夜，尤其高盐浓度洗脱缓！如不能避免，则紧记次日尽早用蒸馏水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。缓冲液不仅会对系统造成腐蚀，而且高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶，堵塞管道，损害系统。

2. 若数天或更长的时间不使用系统，除用蒸馏水彻底清洗系统外，取下柱子，换成管道。然后用20%乙醇再冲洗所有使用的管件通道和所有的流动池一遍，并以此将系统保存。

3.  每月定期保养处理，或当发现假峰等问题出现时，可拆下柱子，并用适宜的管道替换其位置，将所有的缓冲液入口管件置于1 M NaOH中，对所有的入口管件通路运行System Wash Method，以流速为1 mL/min，将整个系统充分冲洗20分钟。然后立即用蒸馏水，将整个系统运行System Wash Method加以冲洗20分钟。

4. 一定要保持实验环境的清洁，当使用仪器时发现缓冲液的泄露或看见机器各部件外表有盐的结晶应即刻用清水浸湿的抹布擦拭去除，以免泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。

5. 当装配部分收集器出口管架时，应根据收集管的长度不同而使用不同的切换口。调整时可将出口管和管夹放在输送臂上的长度导向小孔上，将管夹抵在孔外臂上，将出口管轻推向下到达导向孔的底部，然后上紧管夹螺母。此可确保出口管露出正确的长度，以免造成跳管或收集体积错误情况发生。

6. 微量上样环上样完毕，样品进柱后，应及时注入清水清洗上样环以免蛋白质或高盐堵塞微量上样口及上样环。

7.长期不使用或者其他原因，FPLC 的泵及管路可能有空气，表现为流速不准或没有液体，压力偏低。这时应该把流速调低，接管子用注射器把空气抽出来，prime和FPLC接法不同，可以查看说明书。如果B泵进气，换成B泵，再抽空气。

1. AKTA每个程序跑完一定要尽快把结果另存了，不然会很快被后面的一大堆数据淹没。每个人建自己文件夹。每个蛋白另建文件夹。

2.  事先做准备工作，比如准备柱子，预约机器，不然无法及时下班。

3.  万一电脑显示器上不更新图谱了，可能是与电脑的连接断了，需要关了纯化仪，重启。

4.   样品收集器偶尔会出现跳管子的情况，收集样品要注意从头或从尾对一下管子。

5. 及时清理废液（尤其过夜纯化蛋白时，要检查废液是否装满）。

6.  不要用蛮力摆动输送臂。松开固定输送臂按纽，并将臂升高。（如图示）

►       使用规则

1.  预约：使用纯化仪之前应在对应的纯化仪预约本上预约后在使用；如果临时不适用应在预约本上划去并告知有需要的同学。

2. 上样孔的维护：无论是用Super loop还是微量上样环，使用完毕后，应立即用纯水清洗整个通路，以去除残留在上样环与上样孔中的样品及buffer，以免长期堆积导致结晶堵塞。

3.  连接管的维护：为了防止连接管堵塞（特别是上样环），每次纯化完毕卸下柱子后，应当将所有用过的连接管用纯水冲洗后，再放起来备用。

4.   收集管清理：每次用完仪器后，应及时回收收集管，清理收集盘，以免影响下一位同学使用。

5.  仪器清理：纯化过程中，如果遇到管道漏液，应及时旋紧接头，用抹布擦去液体，并用湿毛巾再擦一遍，避免仪器零部件腐蚀。

6.  接头的使用：为避免滑丝与折断，连接管上的接头不应旋得过紧。

7.  连接管的存放：如果连接管太长，应将连接管盘成圆形存放，以免连接管被卡而造成折损

8. 仪器使用完毕应马上用清水冲洗整个系统泵，防止盐在管路中结晶。

9.  UV灯的维护：仪器使用完毕且系统泵清洗过后，如果后面没有同学使用应将电脑与纯化仪关机

1.  金属螯合亲和色谱，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Fe³⁺发生特殊的相互作用，利用这个原理可以把富含组氨酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的。

2. 分子筛（size-exclusion chromatography）是指具有均匀的微孔，其孔径与一般分子大小相当的一类物质。常见分子筛为结晶态的硅酸盐或硅铝酸盐，是由硅氧四面体或铝氧四面体通过氧桥键相连而形成分子尺寸大小（通常为0.3~2 nm）的孔道和空腔体系，因吸附分子大小和形状不同而具有筛分大小不同的流体分子的能力。

3. 离子交换层析（ion exchange chromatography）根据蛋白质表面的电荷的不同分离蛋白，带电荷的蛋白和层析填料上相反电荷之间的可逆相互作用进行分离。然后改变条件，结合的组分分别被洗脱下来。

4.  疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。

5.  Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的细胞壁表面蛋白，分子量为42 kDa；Protein G是C型或G型链球菌（Streptococcal bacteria）表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）结合，结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区，但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合，而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时，两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可用于免疫沉淀或抗体的纯化。

6.  GST柱是一种旨在利用谷胱甘肽亲和凝胶的高度选择性结合，通过一步法直接从细胞裂解液中对重组谷胱甘肽-S-转移酶标记蛋白进行纯化的试剂。GST融合蛋白是在温和，非变性的条件下洗脱得到的，可以保证蛋白的抗原性和活性。

►       镍柱简介

1.  HisTrap^TM FF 基本信息

2.   HisTrap^TM HP基本信息

3.  HisPrep^TM FF基本信息      

►       镍柱清洁方法

1.  使用镍柱前，先用两个柱体积（column volume，CV）的水洗去柱子里的酒精，再用2 CV的Ni-Binding buffer将柱子中的水换成buffer，连接柱时必须湿接。

2.   使用完毕后，先用2 CV ddH₂O清洗，最后用20%酒精保存柱子。当柱子使用多次以后或发现压力增加或者颜色变黑，需要对柱子进行深度清洗和重新灌镍。以下是镍柱的清洗步骤。