1. 要学习和掌握实验室伤害救护常识，经常对学生进行安全教育，以预防为主，确保师生和国家财产安全。
2. 实验前应熟悉每个具体操作中的安全注意事项，对可能发生的事故有高度警惕，严格遵守操作规程，杜绝安全事故的发生。
3. 严禁在实验室内饮食或把食物带进实验室，实验后必须仔细把手洗净。
4. 实验人员进行实验时应当穿着实验服，严禁戴乳胶手套开门。
5. 实验过程中应时刻注意对个人的防护，进行有危险试剂的实验时，要佩戴护目镜、口罩、手套及防毒面罩进行防范；对于有挥发性的有毒试剂，应在通风橱中进行实验。
仪器安全 (Equipment Safety)
1. 使用电器时要谨防触电，确保用电安全。不要用湿的手、物接触电源，教师要严格控制学生实验用电，实验室供电线路的布设及保险丝的选用，要符合安全供电标准。
2. 实验室要配齐防火、防盗等安全设施，并定点布设，定期检查，做到使用方便，时刻保持良好状态。
3. 实验室要有三废（废气、废液、废渣）处理措施，不得随意排放超剂量废气、废液、废物。不得随意丢弃用过的实验药品和容器。
4. 为避免引起事故，超净台内不要放不必要的物品，用完后拿出放到超净台上方。
5. 超声破碎仪功率是1200 W，破碎时功率最好不要超过50%（建议10%，10~20 min），用完用ddH2O冲洗探头。
6. 烘箱中的物品及时取出，烘箱内无物品时关掉烘箱。
7. 高压灭菌锅开机后检查水位，禁止低水位灭菌，废液瓶的水要及时倒出。灭菌锅内物品不要太满及倾斜，以免溢出。灭菌锅压力降到常压，温度降到80 °C以下，才能打开。
8. 离心机要严格配平，旋紧转头内盖，离心机用完后把内壁擦干净，关掉后把离心机盖打开。转子要经常清洗，倒置晾干。
9. 摇床最高转速不得超过220转/分，摇瓶上须写上使用人，蛋白名称，日期。如果摇瓶在摇床内破裂，要立即停止，摇床要定期紫外照射灭菌。
10. 纯化仪、摇床须登记使用。
11. 金属煮样器使用时禁止往样品孔加水或其它溶液。
12. PCR仪使用完毕后请及时盖上盖子，以免沙尘吹入金属网格。
13. 显微镜使用完毕后要及时关闭电源，另外使用时间过久也应关闭电源让机器降温后再开启使用。
14. 晚上最后离开的人员需要对实验机器进行检查，除冰箱，制冰机，水浴锅外，全部仪器应切断电源，同时应关闭空调、日光灯。
安全管理制度（Safety management system）
实验室安全要安全第一、预防为主,实验仪器规范操作，有毒有害化学试剂的规范使用及安全防护，具体如下：
1.实验仪器设备
1) 各种类型离心机需要严格配平，离心瓶、转子及时清洗，用完放回原位。用完关电源，打开盖子。
2) 用完仪器，比如PCR仪，灭菌锅，离心机，摇床，照胶仪，如果后续没人用，需要关电源。PCR仪器需盖上盖子防尘。
3) 细胞间和生物安全柜，经常整理，开紫外灯灭菌。离开要关灯
2.实验废弃物
1) 收菌后的培养基，用漂白粉处理后，方能倒入下水道。
2) 有毒物质不能直接扔到普通垃圾桶，单独放入危害化学物品桶。
3) 琼脂糖胶（含EB）单独放在专业收集桶；
4) 破碎玻璃单独收集，标注后方能扔掉。
5) 试剂空瓶集中放在指定的箱子里，管理员集中收集和处理。
3.有毒有害化学药品使用
1) 使用有毒有害试剂前要充分了解试剂的物理化学等性质，以及发生意外时正确处理方法，做到心中有数。
2) 尽量避免直接接触，不要用化学溶剂去洗手，更不要误服，特别是接触到腐蚀性化学品时，要立即用大量的清水冲洗。
3) 易燃易爆场所禁止使用明火，如果确实需动用明火，如进行烧焊等，事先要得到批准，并做好充分的防范措施。
4) 对于没有使用完的危险化学品不能随意丢弃，否则可能会引发意外事故。
5) 要按规定戴好防护用具，防止实验过程过程中受到伤害。
日常卫生管理制度（Sanitation management system）
1. 实验室实行每日轮流值日，负责实验室卫生及茶水间卫生等职责。
2. 值日完成签日期并提醒下一位值日生。
3. 实验台、试剂架和冰箱按照就近原则分配，使用人负责安全和整理，互相监督，尽量保持整洁。
4. 超净台用完以后要及时清理，用酒精擦拭干净，及时清理垃圾。
5. 及时把37 °C恒温培养箱中细菌培养皿拿出清理；及时把37 °C摇床中LB试管、摇瓶拿出清理。
6. 公用实验台，比如电泳区、PCR区、天平区，用完随即收拾。
7. 水池区的器皿须先用自来水冲洗干净，最后用dH2O冲洗，水池边不能放太多东西，量筒烧杯放回原处。
8. 保持电泳区整洁，电泳结束后清洗电泳槽，胶板，梳子等，放在指定地方晾干备用，微波炉用完需将表面和内部液体擦洗干净。
9. 处理实验过程中的菌液，要加漂白粉处理方可倒入水池。处理平板时，不能将固体培养基直接倒入垃圾桶，须放保鲜袋内加漂白粉处理，封闭后灭菌再扔掉。
10. 禁止移液器接上枪头后平放台面，移液器用完及时调到最大量程，超净台和电泳区的专用移液器不可拿至别处。若取用他人的移液器，用完须放回原处。
11. 照胶仪用完及时关灯。文件保存到各自文件夹。并把废弃胶扔掉。；电泳样品立即收走，不然会被扔掉。
12. 希望大家严格按照值日表安排时间按时值日，原则上不允许漏值，一旦因特殊原因漏值，希望在第二天9点之前补值，若不能及时补值，则罚值日一次。
每日值日生职责（Daily clean duty）
1. 整理水池边台子和水池。
2. 负责公共区域整洁卫生。
3. 收集离心管和盖子。
4. 整理培养皿。
5. 拖地、倒垃圾。
6. 茶水间清理。
1. 目的
规范实验室试剂的管理，遵循既有利于使用，又要保证安全的原则，管好用好化学药品，加强安全教育。
2. 范围
实验室内所用试剂药品。
3. 职责
1) 试剂药品保管人员严格执行药品保管制度，做到试剂药品的安全保管和使用领取。
2) 实验室管理人员负责实验室操作人员试剂药品的安全使用。
3) 实验室操作人员准确掌握试剂药品的使用，防止出现误操作。
4. 试剂的保管
1) 化学试剂应指定专人保管，管理人员要建立化学药品（化学药品）各类帐册，药品购进后，及时验收、记帐，使用后及时消帐，掌握药品的消耗和库存数量；不外借（给）药品，特殊需要借（给）药品时，必须经领导批准签字。
2) 在固体试剂和液体试剂及化学性质不同或灭火方法相抵触的化学试剂应分柜存放。
3) 受光照易变质、易燃、易爆、易产生有毒气体的化学试剂应存放在阴凉通风处, 易燃易爆物应远离火源。有防火防盗安全设施。易挥发试剂应贮放在有通风设备的房间内。
4) 剧毒试剂应专柜存放，双人双锁保管。
5) 试剂使用应有记录，剧毒试剂的领用需实验室负责人签字。
6) 配制的试剂应贴标识，注明试剂名称、浓度、配制时间、有效期及配制人。无标签药品，不能擅自乱扔、乱倒，必须经化学处理后方可处置。实验室中摆放的药品如长期不用，应放到药品储藏室，统一管理。
7) 每月需要检查试剂是否过期，过期试剂应及时妥善处置。配制的试剂除有特殊规定外，存放期不应超过三个月。
8) 应定期检查试剂是否齐全，所缺试剂应及时申请购买。
9) 标准物质应按规定存放，定期检查是否完好，每次使用必须有相应的记录。标准物质证书统一存放在资料柜。
10) 要加强对火源的管理。化学药品储藏室（橱）周围及内部严禁火源；实验室的火源要远离易燃、易爆物品，有火源时，不能离人。
11) 要经常检查危险物品，防止因变质、分解造成自燃、自爆事故。对剧毒物品的容器、变质料、废渣及废水等应予妥善处理。
5. 试剂的使用
1) 取用化学试剂前应检查试剂的外观，注意其生产日期，不得使用失效的试剂。如怀疑有变质可能时，应经检验合格后再用。使用中要注意保护瓶上的标签，如有脱落应及时贴好，如有损毁则应照原样补全并贴牢。
2) 取用液体试剂只准倾出使用，不得在试剂瓶中直接吸取，倒出的试剂不可再倾回原瓶中。倾倒液体试剂时应使瓶签朝向虎口，以免淌下的试剂沾污或腐蚀瓶签。
3) 取用固体试剂时应遵守“只出不回，量用为出”的原则，倾出的试剂有余量者不得倒回原瓶。所用牛角匙应清洁干燥，不允许一匙多用。
人事管理制度（Human resource management system）
1. 上班制度
每周一至周六为工作日（周六周日可调休），每天打卡时间为早上9:10之前，下午2:10之前，每天工作时
至少8小时，迟到或早退扣除假期0.5天。补假、调休需要事先申请，并在实验员处做备注。补假、调休需
当天有人监督，同时在打卡记录本上做纪录。如有虚假签到，一旦发现，双方劝离实验室。
2. 休假制度
除法定节假日外实验室每年会有两周（12个工作日）带薪假期，一般分别定于年假一周、暑假一周。扣除
时打卡迟到以及请假剩余的则为暑假。对于假期少的可用周末补，超过假期，也可以按天计算退回每月发
助研费（学校、实验室）。所有不能按时打卡和开展科研工作的情况，都算自动休假，包括各种事由的
假，比如病假、法定产假以外休假、探亲、事假等。超过连续24小时离开合肥，需要事先书面请假，批准
才能离开。假条交给实验员存档。一年假期从2月1日－次年1月底计算。假期不能隔年累积，也不能隔年
支。
3. 离校制度
离职手续需要至少提前一个月办理，在办理离校手续之前，要求正常上班。超出假期或旷工的需要交工资
倍以上罚金。离职时认真填写物品交接表，公共物品交给管理员以便后期重新分配，不许私自转交与
人。
4. 奖惩制度
对于平时科研、打卡、值日、大扫除等表现好和发表文章的同学，年终会有一定的奖励。对于每月打卡的
扣除相应假期，严重者会扣助研费。如有虚假签到，一旦发现，劝离实验室。对于日常值日不及时及实验
作不规范的行为将酌情采取罚款措施。
科研过程管理制度（Scientific research management system）
1. 实验室试剂耗材订购
1) 订购人需在试剂申购本上登记，包括名称、要求和数量，如经过初步询价的（包括公司、品牌和价格）尽量把相关信息写详细。
2) 试剂耗材需提前申购，适当储备6个月到1年使用量。
3) 常用大剂量试剂最后一个包装拆封是即可登记预定。
4) 个人使用试剂耗材到货后申购人负责清点，包括具体型号和数量。把送货单和发票交给实验室管理员保留。
5) 公用或常用化学试剂到货后，实验管理员清点后交于化学试剂管理员管理保存。
6) 不常用试剂订购前最好确定是否还有库存或近期是否有订购。
2. 实验过程
1) 及时做好原始实验记录，保存实验数据。按照蛋白或课题及时整理，便于汇报和讨论。
2) 所有个人配置的样品、试剂、溶液、培养皿、细胞、离心管、LB培养瓶（管），都需要写上姓名，内容，日期。比如 4M Imidazole pH 8.0，DXM
3) 及时清理个人实验废弃物瓶，及时清理个人及公共试验器具，尽量做到实验完毕，实验台面及物品恢复实验前的状态。
3. 实验成果分享
1) 双周工作汇报。每月14日或月底前一天交给组长汇总修改。
2) 轮流组会报告（文献或工作汇报），无特殊情况，不得调整。作报告人员提前准备会议室。所有人员不得迟到、缺席、早退。每周四晚上19:00-21:00为组会时间进行文献和工作汇报，新生在选课时避开此时间段。
3) 具体分组（不断更新）
4) 组长职责：
组织小组讨论会，指导小组内低年级课题
培训小组内外成员实验技能
负责收集指导工作汇报
轮流组织实验室活动
参与实验室管理
4. 答辩制度
硕士或博士，必须在学校规定年限之内（硕士3年，硕博连读6年）申请答辩。申请答辩前，需要把课题全
做完或者交接，论文投出去确保发表或者接收。无论结果如何，必须在一个月内离开实验室。如果需要第
次答辩，费用自理。
日常奖惩制度（Reward and punishment management system）
1. 日常出勤及可研工作表现良好者，实验室将于年终酌情给于相应的奖励。
2. 积极参于院级、校级及其以上活动并获奖者，实验室将设置相应的配套奖金。
3. 发表学术论文对于发表优秀论文者，实验室将会根据期刊等级，给予不等金额的奖励。
4. 规范使用各种仪器，有些特殊仪器（如分析天平）需要及时关闭的应及时关闭，一经发现不过范操作，进行罚款处置。
5. 屡次违反实验室相关规定而不听劝阻者，扣除当月的实验室劳务费用。
6. 实验室日常值日遗漏或值日不全者，补值并罚款，罚款将作为实验室费用用于日常开销。
1.2 酶的使用指南
使用方法（FOR USE）
本实验室的酶主要是做分子克隆时使用的，可以分为限制性内切酶、Pfu、Taq酶、T4 连接酶等。TEV是纯化蛋白时使用的，用来酶切TEV酶切位点，将tag从目的蛋白上切去。
TEV蛋白酶是本实验室自己纯化的，由于每个批次的浓度及效率不同，用量在用前咨询TEV管理者。一般在2~5 mg/mL左右。酶切一般在4 °C冰箱，酶切按照酶：底物＝1：20摩尔比过夜即可，但也可以在不同的温度上调节酶切时间。下面的表格是Thermo Scientific公司提供的在不同温度和不同时间下酶切底物的效率。
用1 U TEV酶切3μg底物时在不同温度和时间下的酶切效率
Substrate Hydrolyzed | ||||
Time (h) | 4 °C | 6 °C | 21 °C | 30 °C |
0.5 | 34 | 58 | 56 | 77 |
1 | 58 | 80 | 78 | 90 |
2 | 71 | 99 | 99 | 99 |
3 | 84 | 99 | 99 | 99 |
1.限制性内切酶是用经典方法做分子克隆时必不可少的酶，一般用的是双酶切的方法。由于每种酶保证其最优效率的buffer不同，因此在搭配不同的酶时需要在NEB网站上查最优buffer（见附录）。
2. 酶在-20 °C下是不会结冰的，因为其储存溶液中含有50%甘油用作保护剂，因此如果发现自己的酶结冰，那么肯定是里面进水了，这会导致酶的效率大大降低。而作为保护剂的甘油抑制酶切过程，因此不建议多加酶。控制体系中甘油浓度不超过10%。
3.Pfu X-1、Pfu和Taq酶都是本实验室自己纯化的酶，浓度极高，需要稀释至0.5~1 mg/mL再使用。一般20 μL体系中加入0.2 μL即可。Pfu X-1和Pfu的效率是1 kb/20 s，Taq酶的效率是1 kb/1 min。目前Pfu X-1、Pfu用的缓冲液是10×Pfu buffer、5×GC buffer和5×HF buffer三种。Taq用的缓冲液是10×Taq buffer。
4.实验室有2×Taq mix用于菌液鉴定，使用时只需要加入模板和引物，效率是1 kb/1 min。
5.T4 连接酶也是本实验室自己纯化的，也有商用的如全式金和GenStar两个品牌的T4连接酶。本实验室自己纯化的T4连接酶与NEB的10×Ligase buffer或者实验室自己配制的2×Quick ligase buffer配用，商用的用对应的buffer即可。连接时间一般是1 °C 过夜连接，快速连接时间一般是室温下半小时（也可以更长，根据加入的insert和vector量来决定）。相关buffer配方见附录。
申请（FOR APPLICATION）
1. 所有本实验室自己纯化的酶不需要申请，直接在-20 °C最上一层的冰盒中取用。以下申请规则适用于所有购买的限制性内切酶、Pfu、Supermix、T4 ligase、NEB酶切buffer、NEB 10×Ligase buffer。
2.本实验室所有酶类资源已在百会云端上共享，本实验室每个人需要在百会www.baihui.com上进行注册，并将注册时使用的账号交给刘木子樱，即可看到云端的资源。
3. 每个人可以随时在百会上申请酶，并在上面写清申请日期，每周一晚管理者会将所有酶吸取并集中放在-20 °C，申请人自取即可。同时，申请单上已完成的申请会变灰。
4.Supermix以支为单位（1 mL每支），其余试剂以μL为单位。
5.常用限制性内切酶（Sal I、Not I、Xho I）的申请上限体积为50 μL，其余限制性内切酶申请上限为30 μL。T4连接酶的申请上限为10 μL。
6.NEB 10×Ligase buffer分装成100 μL/管，NEB buffer 3.1分装成500 μL/管，T4连接酶对应的buffer每次吸50 μL。
7. 任何酶或者试剂不得擅自吸取，被发现后禁止一个月的申请权利。
1.3 甘油冻存菌、引物、质粒、蛋白的保存
简介（INTRODUCTION）
我们实验室所有人都需要做大量的课题，随着课题的进展，会产生很多冻存菌、引物、质粒和蛋白质。那么如何管理这么多的实验产物呢？
先在标准的电子保存记录文档中，预定出冻存菌/引物/质粒在冻存盒中的虚拟位置。在该虚拟位置处，记录下冻存菌/引物/质粒的信息（如名称，序号，状态，冻存时间）。填写好相关信息后，再将冻存菌/引物/质粒放于冻存盒的预定位置，保存到合适温度的冰箱或液氮罐中。最后，对电子保存记录文档和相应的冻存盒，也要进行标号。
甘油冻存菌的保存与复苏
按照菌种类型（如DH5α或者表达菌）的不同，分盒保存。冻存盒中的冻存管，可按冻存时间排列。冻存菌保存在负八十度冰箱或液氮罐中。
► 甘油菌的冻存：
1. 一般保种用的菌液要求浓一些，因此培养时间可以比平时长一些，一般过夜即可。在无菌操作条件下，分别向已灭菌的2 mL冻存管中，加入500 μL菌液和60%甘油溶液，务必充分混匀。
2. 将甘油冻存菌直接保存在负八十度中。该冻存菌可在此条件下保存数年之久。冻存和融化操作将会减少保存年限。
► 甘油菌的复苏：
从甘油冻存菌中复苏细菌，在无菌条件下，打开盖子，使用无菌接种环或灭菌枪头从冻存管中刮取适量冻存菌，划线接种到LB板（含有合适抗生素或无抗）上。操作应适当快一些，以减少冻存管内的融化。
在合适的温度条件下，将划线接种的LB板进行过夜培养。过夜培养后，挑取单个克隆进行后续操作。
▲ 关键步骤：
所有东西准备完全后，再去-80 °C冰箱取出保种菌，划线动作要快，时间拖得太长会融化冻存菌，而这导致保种菌死亡。参考链接：http://www.addgene.org/recipient-instructions/create-glycerol-stock/
引物保存
1. 按照用途，引物分为PCR引物，测序引物。而按照存在状态，引物则分为干粉/薄膜状态、100 μM稀释状态、10 μM稀释状态（10 μM为PCR的通常使用浓度）等三种状态。
2. 测序引物一般有两管（均为干粉/薄膜状态），订引物时可以要求分到两个管装。其中一管可直接保存，而另外一管可稀释其中引物的浓度至10 μM（测序所需浓度）。两管放置可在同一个冻存盒中的相邻位置，按引物序号排列。
3. PCR引物则根据引物的浓度不同（一般只有100 μM和10 μM两种）进行分盒保存。在每一个冻存盒中，按照引物序号依次排列。引物保存在负二十度冰箱中。
4. 引物稀释时先将装有引物的EP管进行离心，12000 g 离心1分钟，将干粉或薄膜状态的引物离心至管底。然后，根据引物管上指示的体积，加入对应量的无菌蒸馏水，使用枪头（不推荐使用涡旋振荡器）吹打混匀，即可得到浓度为100 μM的引物。
质粒保存
1. 按照用途，质粒一般分为PCR模板型质粒（用于扩增目的基因片段）和蛋白表达型质粒（用于表达目的蛋白）。可按照用途的不同，分盒保存。质粒保存在负二十度冰箱中。
2. 此外，也可以将质粒转入合适的感受态菌株中，通过保存菌种的方法达到保存质粒的目的。
蛋白质保存和化冻
新鲜的蛋白样品，活性往往最好。很多时候，需要把蛋白冻存起来，以备以后使用。蛋白一般要浓缩到大于1 mg/mL, 才适合冻存，高浓度更好。一般采用小体积速冻速融的方式冻存于－80 °C冰箱或者液氮中。很多后续实验比如长晶体，不适宜加甘油。因此一般不加防冻剂。
